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【期刊名称】 《中国司法鉴定》
应用免疫胶体金技术结合酚-氯仿法提取甲醛固定组织DNA
【英文标题】 DNA Extraction from Formaldehyde-fixed Tissue by Immuno-colloidal Gold Combined with Phenol-chloroform Method
【作者】 郑长发明绍利牛青山
【作者单位】 大连市公安局西岗分局大连市公安局西岗分局中国刑事警察学院
【分类】 司法鉴定学
【中文关键词】 法医遗传学;免疫胶体金;甲醛固定组织;DNA 提取
【英文关键词】 forensicgenetics; immuno-colloidalgold; formal dehyde-fixedtissue ; DNA extraction
【文章编码】 1671-2072-(2015)01-0042-03
【文献标识码】 Adoi:10.3969/j.issn.1671-2072.2015.01.009
【期刊年份】 2015年【期号】 1
【页码】 42
【摘要】 目的探讨应用免疫胶体金技术结合酚-氯仿法提取甲醛固定组织 DNA 的可行性。方法采用4%普通甲醛溶液室温(15~20℃)下固定肝脏组织10例,不同时间后取样,分别用免疫胶体金技术结合酚-氯仿法和磁珠法提取 DNA, 经 PCR 扩增进行 STR 分型,比较两者差异性。结果甲醛固定时间和 DNA 提取方法影响甲醛固定组织的 STR 分型效能。固定时间在1周至2个月时,两种方法有显著性差异(P<0.05),固定时间在24 h 和5个月以上时,两者无显著性差异(P>0.05)。结论免疫胶体金技术结合酚-氯仿法可用于提取甲醛固定组织 DNA, 在一定固定时间段内,其优于磁珠法。
【英文摘要】 Objective To evaluate the feasibility of extracting DNA from formaldehyde-fixed tissues by immuno-colloidal gold combined with phenol -chloroform method. Method Ten liver tissues were fixed by 4% formaldehyde solution for different duration at 15~20℃. DNA was extracted from these tissues at different time-point by both magnetic bead method and immunocolloidal gold combined with phenol-chloroform method. After PCR and STR genotyping, the DNA extraction results of these two methods were compared. Results The STR profiling efficiency of fixed tissues was relevant to the formaldehyde fixingduration and method of DNA extraction. When the fixed time was from one week to two months, there was significant difference between the two methods of DNA extraction (P<0.05). But no significant difference was observed when the fixed time was within one week or after five months (P >0.05). Conclusion Immuno-colloidal gold combined with phenol-chloroform method can extract DNA from formaldehyde-fixed tissues, and it is superior to magnetic bead method within a certain timeframe.
【全文】法宝引证码CLI.A.1204369    
  
  存档标本是医学和分子生物学研究的珍贵材料之一,也往往是司法鉴定领域的重要实物证据。福尔马林固定液是最常用的组织固定液,其主要成分为甲醛,甲醛对 DNA 双螺旋结构的破坏作用,易造成长片段 DNA 片段获取困难。现有基因组 DNA 提取的方法,如酚-氯仿抽提法、Chelex-100法、磁珠法、硅珠法等都不易从长期甲醛固定组织中提取到有效的基因组 DNA 用于 PCR 反应,满足鉴定需要。本实验采用免疫胶体金技术结合酚-氯仿法提取甲醛固定组织的基因组 DNA, 并与磁珠法比较,期望建立一种有效提取纯化甲醛固定组织 DNA 的方法,提高 STR 基因座的检出率,达到应用于司法鉴定的目的。
  1材料与方法
  1.1材料及仪器
  创伤性死亡尸体的肝脏10例(男、女各5例)取自大连市公安局解剖中心。将组织器官切成1 cm×1 cm ×0.5 cm 大小的组织块,放置到盛有4%普通甲醛溶液的容器中,室温(15~20℃)下保存。分别在1 d、7 d、14 d、21 d、28 d、60 d、150 d 以上各时间点取出组织块,分别切取两个0.1 g 的组织备用。
  40%的甲醛溶液(丹东铭泰化工有限公司);氯金酸(北京意宏安生物科技有限公司;抗-DNA 单克隆抗体(上海吉泰生物科技有限公司);饱和酚、氯仿(丹东铭泰化工有限公司);QIAamp○RDNA Micro 试剂盒(德国 QIAGEN 公司);PCR 扩增仪(美国 ABI 公司);3100遗传分析仪(美国 ABI 公司)。
  1.2方法
  1.2.1免疫胶体金技术结合酚-氯仿法提取组织 DNA
  (1)胶体金的制备:将氯金酸配制成0.01%水溶液,采用柠檬酸盐还原法,将氯金酸制备成约25~30 nm 大小的胶体金颗粒,于密闭的玻璃瓶中4℃保存;
  (2)胶体金的标记:将抗-DNA 单克隆抗体配置至1 mg/mL, 取1 mL 胶体金溶液,依次缓慢加入抗体5μL, 10μL, 15μL, 20μL 震荡观察颜色变化。在15~20μL 间变化不明显,故抗体浓度定为20μg/mL。胶体金标记抗体后即为免疫胶体金,4℃保存备用。
  (3)DNA 提取:用酚-氯仿法提取组织的 DNA, 沉淀加50μL TE 制成溶液,加入15μL 胶体金,振荡15 min, 10000 rpm/min 离心5 min, 吸弃上清,加洗涤液洗涤,离心,重复两次后保留沉淀。
  1.2.2磁珠法提取组织 DNA
  按照 QIAamp○RDNA Micro 试剂盒操作步骤提取固定组织的 DNA。
  1.2.3 PCR 扩增、毛细管电泳检测
  按照 Identifiler 试剂盒说明,直接向1.2.1得到的沉淀中加入 PCR 反应液进行复合扩增,磁珠法加1μL DNA 模板,反应体系均为10μL, 两种方法提取到的 DNA 应用进行 PCR 复合扩增,3100型遗传分析仪电泳分离和激光扫描分析,应用GeneMapperV 3.2软件分析。
  1.3统计学分析
  以扩增出可判别的等位基因数(正确分型9个以上,RFU >150)为标准,对两种方法的结果采用 SPSS19.0软件进行χ2检验,比较两种方法的差异性。
  2结果
  2.1不同基因座检出率情况
  实验对 Amel

  ······

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【注释】                                                                                                     
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  {4}柳燕,李莉,赵珍敏,等.人体组织在非缓冲福尔马林固定剂中的 STR 检测时限[J].中国法医学杂志,2010,25(1):1-5.
  {5} Wellmann U, Letz M, Herrmann M, et al. The evolutionof human anti-double –stranded DNA autoanti bodies[J]. ProcNatl AcadSci, 2005,102(26):9258-9263.
  {6}陈晶.应用免疫胶体金技术提取现场生物物证 DNA 的研究[D].辽宁:中国刑事警察学院,2008.
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