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【期刊名称】 《刑事技术》
直接扩增技术在法医DNA检验中的研究进展
【英文标题】 DNA Direct Amplification: Its Forensic Application and Research Progress
【作者】 沈伟马骏潘豪杰邓明明李翘任文彦
【作者单位】 浙江千麦司法鉴定中心浙江省长兴县公安司法鉴定中心浙江千麦司法鉴定中心浙江千麦司法鉴定中心浙江千麦司法鉴定中心浙江省公安物证鉴定中心
【中文关键词】 法医遗传学;直接扩增;STR分型
【英文关键词】 forensic genetics; direct amplification; STR genotype
【文章编码】 1008-3650(2018)05-0390-06
【文献标识码】 A DOI: 10.16467/j.1008-3650.2018.05.010
【期刊年份】 2018年【期号】 5
【页码】 390
【摘要】 直接扩增技术具有缩短检验时间、提高灵敏度、减少操作步骤和降低污染风险等优点,故可较大程度地节约人力、物力、财力及时间,因而该技术的发展对数据库建设、重大紧急案件和大规模灾难性事故等均有重要的应用价值。目前,直接扩增已在数据库建设中得到了广泛应用,在案件检验中其应用也在不断深入和拓展。本文对直接扩增技术的特点、商业化扩增试剂盒在直扩中的应用、常见与接触DNA检材的直扩及其影响因素和快速直接扩增技术在法医DNA检验中的研究状况进行了综述,介绍了在采集接触DNA样品时棉签类型和处理试剂对直扩的影响,阐述了游离DNA的发现及其意义,希望能为相关研究和应用提供参考。
【英文摘要】 DNA direct amplification is of many advantages such as saving time, improving sensitivity, reducing operation steps and lowering the risk of contamination, thereby capable of economizing the workload, material expense, financial resources and time so that its development and application unfold important values for the database construction, emergent and/or high-profile cases as well as the grave disasters. Currently, DNA direct amplification has been widely used in the database construction, being also deepened/expanded of its utilization into the routine casework. This paper is to provide a comprehensive view of DNA direct amplification about its forensic researches and applications through explaining the features of the technology, introducing the application of relevant commercial kits, analyzing the practice of this technology into testing the commonly-seen/contact samples, together with the influential factors of direct PCR and rapid direct amplification. In addition, the impact is also described on the types of swab and reagents in direct amplification, and accordingly the discovery and significance of free DNA being elucidated as well.
【全文】法宝引证码CLI.A.1248888    
  
  以STR为标记的法医DNA分型技术,以其自动化程度高、快速、灵敏、准确、稳定、重复性好等优特点{1},而成为当前公安机关案件侦破及鉴定科学证据系统中的科技利器。目前法医DNA分型技术涉及到DNA提取与定量、PCR扩增及电泳检测等多个操作步骤,故对于某些急、难案件,检验速度不能满足需要。近年来,随着生物物证DNA检验技术和商业化复合扩增试剂盒的发展,直接扩增技术(简称直扩技术)由于具有缩短检验时间{2-3}、提高灵敏度、减少操作步骤和降低污染风险{4}等优点,得到了国内外法医从业者的广泛关注和研究运用{5-7},现本文对此作综述。
1直扩技术及特点
直扩技术又称直接PCR或免提取扩增技术,是将样本不经DNA提取或其它前处理步骤而直接加入PCR反应体系并获得扩增产物的操作{8},故其对目标载体的选择或更有针对性,能在保证获得足够模板DNA的同时,更易得到单一个体来源的DNA分型。与传统方法相比,直扩技术具有如下优点:首先省略了DNA提取及DNA定量步骤,仅通过扩增和检测两个步骤即可获得完整的STR分型,大大缩短了DNA检验的时间;其次在检验过程中不需更换反应管,这样就避免了常规检验过程中转移样品或试剂可能造成的污染;另外,节约了提取试剂和相关耗材。该技术快速、准确、高效,能极大地提高我国当前DNA数据库建设水平、增强我国公安机关应对一些大规模灾难性事故、群体性突发事件DNA样本检验的处理能力{9}。尽管目前提取DNA的方法和试剂仍在不断改进,但是各种方法在提取过程中的转移和洗涤等步骤都会导致不同程度的DNA损失{10-12},且还可能引入外源性的DNA污染{13}。直扩技术通过直接把DNA载体放入PCR管中扩增,可避免提取过程中DNA的损失,又能减少污染风险。Swaran{14}对玻璃、塑料、陶瓷和不锈钢四种载体上的DNA进行直扩和提取的比较,发现四种载体上的DNA经过直扩后得到的荧光信号均高于其对应提取物,并且等位基因缺失的概率更小。当前直扩技术已在衣物{4}、血迹{14}、全血{15}、唾液{16}、毛囊{17}、指纹{18}、指甲{19}等检材中得到了成功的应用。
2商业化STR扩增试剂盒所用的直扩技术
2.1商业化直扩试剂盒的应用
目前已有的直扩STR试剂盒,如Identifiler Di-rect、PowerPlex 16 HS、Typer15 Plus、PowerPlex 18D和GlobalFiler Express等,都能够在有血红素和其他PCR抑制剂存在的情况下实现PCR扩增,因此可以不对生物样本进行提取纯化而直接扩增{8}。这些直扩试剂盒所针对的生物样本大都是基于FTA卡提取的血细胞和口腔上皮细胞,主要用于DNA数据库建设。国内外很多学者对此类商业试剂盒的直扩效果做了验证和比较{20-22}。Myers{23}对IdentiFiler Direct 、IdentiFiler Plus、PowerPlex 18D三种试剂盒经由FTA卡进行了直扩比较,发现IdentiFiler Direct和PowerPlex 18D的成功率约为96%,IdentiFiler Plus的为94%,但是有15%的分型会在某些基因座出现加A不完全现象。商业化直扩试剂盒促使直扩技术在国内外数据库建设中应用趋于广泛{24-26}。
2.2商业化非直扩试剂盒中直扩技术的应用
目前大部分商业化试剂盒中的PCR Buffer增加了增强剂和抗抑制剂,可以抵抗检材基质上的抑制效应,提高低浓度样品的成功率,从而使非直扩的商业化试剂盒进行直扩也有不错的效果。刘亚举{27}使用Identifiler Plus试剂盒对常见的案件生物检材进行直扩,结果显示用Identifiler Plus试剂盒直扩方法简单、快速稳定、检材量小,缩短了DNA检验时间,可在实际检案中选用。钱水{6}对330份案件检材进行了PowerPlex 21试剂盒的直扩,结果显示污染轻的新鲜检材均能获得良好效果,污染重或腐败降解检材直扩效果不理想。330份检材同步用磁珠法提取后再用PowerPlex 21试剂盒扩增检验,两者检材检出成功率差别不明显。Brito{28}使用GlobalFiler试剂盒对一起强奸案和一起凶杀案中的检材进行直扩,强奸案的检材检出了受害者和嫌疑人混合的DNA分型,凶杀案则在嫌疑人的衣服上检出了受害人的DNA分型。
3常见生物检材的直扩
PCR起始步骤的95℃热启动也可以裂解细胞而释放出DNA{4},所以免提取直接扩增受到众多学者的研究和探索。但对于有限量或微量检材,是否采用直扩还是先行DNA提取需慎重,否则直扩后,就无法再进行其他系统检验了。
3.1毛发直扩
Ottens{17}对30根毛发的毛囊以NGM试剂盒进行直接扩增,均获得了成功分型,其中还包括保存了5年的毛发。他还对毛发的直扩做了优化,指出直接扩增省去了提取步骤,但因无法进行DNA定量,有些毛发直扩会因模板太浓导致双肩峰或pull-up峰,而减少扩增循环数又有加大等位基因丢失的风险。稀释PCR产物应是一个很有效的方法,既可以减少PCR的伪峰,又不会增加等位基因丢失的可能性{29}。高波{30}比较了Power Plex21直接扩增法与磁珠提取扩增法用于带毛囊毛发STR检验的效果,发现自然脱落带毛囊的毛发直扩检出STR基因型的成功率为55%,磁珠提取后扩增检出STR基因型的成功率仅为25%,故直扩法比磁珠提取后扩增更适于带毛囊毛发的STR检验。
3.2血液或唾液直扩
血液和唾液的直扩技术已较成熟,相关文献也很多,已经证实对此类检材直扩方法简单、快速、稳定、检材用量小,可在实际检案中选择使用[6, 14, 16, 22]。Dargay{31}对烟头、秸秆、草、树叶、木片和七种不同类型织物上的血液和唾液进行了Yfiler Direct、Yfiler Plus和PowerPlex Y23三种试剂盒的直扩,大部分分型都获得了成功。钱水{6}指出对于烟蒂取其海绵部分直接扩增效果明显优于烟纸,实验中20枚现场提取的烟头,以PowerPlex21试剂盒直扩,15枚直接扩增及磁珠提取后扩增均成功分型,2枚泡过水后晾干的烟头,剪取海绵直接扩增只检出性别及3~5个小片段基因座,而用磁珠提取后能成功检出全部基因型。李林{32}使用Identifiler Direct PCR试剂盒直扩,20份烟蒂中有2份未得到分型图谱,分析原因可能是剪取的检材脱落细胞含量少,故经再次取材而检验成功。因此针对烟蒂唾液斑类检材,在使用直接扩增法时应尽量选取嘴唇接触或唾液斑痕明显之处进行剪取,也可多剪取几处分别扩增而相互佐证,以保证得到正确的分型结果。
3.3肋软骨直扩
李林{32}使用Identifiler Direct PCR试剂盒对较为新鲜的肋软骨直扩,成功率100%。钱水{6}和王传海{33}均采用PowerPlex21试剂盒对肋软骨进行了直扩,成功率分别为75%和95.45%。钱水还发现,对于较脏、污染重的检材,直接扩增往往分型失败,而磁珠提取后扩增可成功检出全部基因型{6}。王传海则认为,磁珠法和直扩法成功率完全一致,直扩法检验未得到STR分型的检材,采用磁珠法提取DNA后扩增检验也未得到STR分型,另外取材应尽量选取中间部位以提高直扩成功率{33}。
3.4衣物上的DNA直扩
Linacre{4}等通过以2男1女为志愿者对各种类型的布料进行接触模拟实验,证实直扩法比提取法能得到更多的等位基因和更高的峰值。杨电{34}通过比较擦拭直扩法和粘取磁珠法检测衣物脱落细胞DNA,使用PowerPlex21试剂盒扩增,发现两种方法获得的衣物接触DNA的STR图谱在成功率、峰型、峰高和均衡性方

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【注释】                                                                                                     
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引用本文格式:沈伟,马骏,潘豪杰,等.直接扩增技术在法医DNA检验中的研究进展[J].刑事技术,2018, 43(5):390-395.
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