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【期刊名称】 《刑事技术》
两种提取骨骼、牙齿DNA的方法
【英文标题】 Two Methods for Extracting DNA from Ordinary and Aged Bones or Teeth
【作者】 宋振宋三平凃政赵杰贺永锋
【作者单位】 陕西省公安厅刑侦局陕西省公安厅刑侦局公安部物证鉴定中心陕西省公安厅刑侦局陕西省公安厅刑侦局
【分类】 刑事侦察学
【中文关键词】 骨骼;牙齿;DNA提取;STR分型;Kingfisher自动化系统
【英文关键词】 bones and teeth; DNA extraction; STR typing; Kingfisher automatic system
【文章编码】 1008-3650(2018)01-0039-04【文献标识码】 A
【期刊年份】 2018年【期号】 1
【页码】 39
【摘要】 目的建立提取骨骼、牙齿DNA的新方法。方法收集380例骨骼、牙齿检材,其中347份为常规骨骼、牙齿(常规组),33份为陈旧骨骼、牙齿(疑难组)。常规组检材以Handy-Eco仪器、疑难组则用冷冻研磨仪研磨成粉,以Kingfisher自动化系统提取DNA,用Identifiler Plus进行STR分型检测。结果用Handy- Eco Kingfisher法(H-K法)成功提取345例常规骨骼、牙齿检材的DNA,成功率99.42%;用Freeze-mill Kingfisher法(FM-K法)成功获取32例疑难骨骼、牙齿检材的DNA,成功率96.97%。结论采用H-K法和FM-K法对骨骼和牙齿DNA的检验成功率较高,可选择应用于工作实践中。
【英文摘要】 Objective To set up new methods for the extraction of DNA from ordinary and aged bones or teeth. Methods 380 pieces of bone and tooth,347 ordinary and 33 aged ones, were collected from the previous routine casework. Handy- Eco instrument was selected to grind the ordinary samples into powder while the aged by Freezer Mill apparatus to achieve the same efficacy. DNA was extracted from the above-processed samples with Kingfisher automatic system (thus the H-K and FM-K methods), with the Identifiler Plus kit to test the STR profile. Results DNA was shown of 15 autosomal STR loci of Identifiler Plus from the 345 ordinary samples, presenting the extraction rate as 99.42%.32 aged samples exposed their 15 autosomal STR loci of Identifiler Plus, bringing up the DNA extraction rate about 96.97%. Conclusion The established methods here are efficient to extract DNA from either the ordinary or aged bones/teeth, applicable in forensic practice.
【全文】法宝引证码CLI.A.1236490    
  骨骼和牙齿的组织结构可有效保护骨细胞与牙釉质,故而能抵抗外界环境因素的影响{1}。因此,对高度腐败及白骨化的尸体进行尸源鉴定,从骨骼和牙齿中提取DNA并进行STR分型检验是可赖以利用的重要技术手段。但传统脱钙法存在提取时间长、有机纯化试剂有毒、得到的DNA浓度低及易于污染等缺点{2-4},特别是当检材为陈旧骨骼、牙齿时其提取成功率就更低。本文利用Handy-Eco仪器和FreezerMill冷冻研磨仪结合Kingfisher自动化提取系统,提取骨骼和牙齿DNA,研究其对法医学检案的可应用性。
  1材料与方法
  1.1检材来源
  本实验室日常检案积累的380例骨骼、牙齿检材,分成常规和疑难两组:常规组包括347例骨骼、牙齿检材(保存年限:2年以内);疑难组包括33份陈旧骨骼、牙齿检材(其中8份为陈旧骨骼、最长保存年限46年;25份为牙齿、保存年限最长者22年)。
  1.2主要仪器与试剂
  9700型PCR扩增仪、3500型遗传分析仪、Iden- tifilerPlus试剂盒(Life公司);骨骼专用磁珠法DNA提取试剂盒(长春博坤公司,Kingfisher提取仪专用); Handy-Eco仪器(韩国世洋公司);6770-230Freezer- Mill冷冻研磨仪(SPEXSamplePrep公司);Kingfisher自动化提取系统(Thermo公司)。
  1.3检材预处理
  1.3.1 常规组骨骼、牙齿预处理(保存2年以内)
  取常规骨骼或牙齿检材,用手术刀刮净表面,清洗,晾干,以5%次氯酸钠溶液处理15 min,蒸馏水清洗3~4次,无水乙醇浸泡一次,除去残余水分,紫外灯下照射20 min。将上述检材用Handy- Eco仪器研磨成粉,取50~150 mg,备用。
  1.3.2疑难组骨骼(牙齿)预处理(保存2年~46年)
  骨骼与牙齿的前处理同1.3.1常规组。处理完毕后,陈旧骨骼检材在完整股骨头一端取4~6块(1~2 g/块)骨碎片;陈旧牙齿检材选取整个牙齿。将上述检材用6770-230 Freezer Mill冷冻研磨仪振荡研磨至粉末状,备用。
1.4检材DNA提取
1.4.1 Handy-EcoKingfisher法(H-K法)
  1)按上述处理的常规组,每份取粉末约50 mg,置于1.5 mL离心管中,加入骨骼专用磁珠法DNA提取试剂盒的裂解液350μL、蛋白酶K(20 mg/mL)20μL、1mol/L DTT 20μL(新鲜配制);2)在56℃恒温金属浴(Eppendorf公司)混匀(750 r/min低转数震荡)并孵育过夜;3)10000 g离心10 min,取上清液用Kingfisher自动化系统提取骨粉DNA,模板DNA最终洗脱体积20μL。
1.4.2 H-K法优化比较
  选取常规组中同一个体的骨粉和牙粉、疑难组中22年的骨粉(对照),按上述H-K方法提取DNA,并分别设置不同样本量(50、100、150 mg)及不同消化时间(6、18 h),以选择确定最佳样本量和消化时间。
1.4.3 Freeze-millKingfisher法(FM-K法)
  1)取8份已处理好的陈旧骨骼粉末各约5 g,处理好的25颗陈旧牙齿粉末各约1.5 g,于15 mL离心管中加入骨骼专用磁珠法DNA提取试剂盒裂解液5 mL、蛋白酶K (20 mg/mL)200μL、1 mol/L DTT 200μL(新鲜配制);2)56℃恒温金属浴(Ep- pendorf公司)混匀(750 r/min低转数震荡)并孵育过夜;3)按前量补加DTT和蛋白酶K ;4)再次重复
  (2)的处理操作;5)10000 g离心10 min ;6)取上清液用Kingfisher自动化系统富集所提取的骨粉及牙粉DNA,模板DNA最终洗脱体积15μL。
1.5 STR分型检测
  用Identifiler Plus试剂盒进行复合扩增,反应总体积10μL,其中DNA模板4μL。反应条件:95℃、11 min ;94℃、20 s ;59℃、3min ;60℃、10 min ;循环数30。PCR产物在3500遗传分析仪上进行毛细管电泳,GeneMapper ID-X V1.4软件对电泳数据做分析。
  2结果
  2.1 H-K法提取常规组骨骼、牙齿DNA的结果
  H-K法提取DNA结果见表1。由表可见,保存时间在2年内、不同保存环境的常规组检材采用H-K法提取成功率达到99.42%(成功获得15个STR分型结果)。
  表1 H-K法提取DNA结果

┌───────────┬─────────┬───────────────┐
│保存环境       │检材类型     │H-K法15*(检材数/成功数)    │
├───────────┼─────────┼───────────────┤
│露天         │骨骼或牙齿    │239/238(污染1例)       │
├───────────┼─────────┼───────────────┤
│室内         │骨骼或牙齿    │21/21             │
├───────────┼─────────┼───────────────┤
│土埋         │骨骼或牙齿    │37/37             │
├───────────┼─────────┼───────────────┤
│水浸         │骨骼或牙齿    │46/46             │
├───────────┼─────────┼───────────────┤
│酒精         │骨骼或牙齿    │3/3              │
├───────────┼─────────┼───────────────┤
│化粪池        │骨骼       │1/0              │
├───────────┼─────────┼───────────────┤
│提取成功率      │         │99.42%            │
└───────────┴─────────┴───────────────┘

  注:15*表示获得15个STR分型结果
  2.2 H-K法优化后提取DNA的结果
  按本文1.4.2项选取检材以及同样的条件与操作进行分组并检验,所得STR分型结果见表2。可见,随着消化时间的延长和消化骨粉、牙粉量的增加,STR检验的成功率也在增加。因此,对于常规的骨骼、牙齿检材,选用100 mg骨粉或牙粉量、消化时间18 h,就可基本上成功获得STR分型结果。但对于22年的陈旧检材,H-K法检测成功率为0,全部检测失败。

┌────┬───┬────────┬──────────┬──────────┐
│检材  │消化 │50mg(检材数/成功│100mg(检材数/成功数)│150mg(检材数/成功数)│
│    │时间 │数)       │          │          │
├────┼───┼────────┼──────────┼──────────┤
│常规  │6h  │1/0       │1/1*        │1/1         │
├────┼───┼────────┼──────────┼──────────┤
│股骨  │18h  │1/1*      │1/1         │1/1         │
├────┼───┼────────┼──────────┼──────────┤
│常规  │6h  │1/1*      │1/1         │1/1         │
├────┼───┼────────┼──────────┼──────────┤
│牙齿  │18h  │1/1       │1/1         │1/1         │
├────┼───┼────────┼──────────┼──────────┤
│22年  │6h  │1/0       │1/0         │1/0         │
├────┼───┼────────┼──────────┼──────────┤
│股骨  │18h  │1/0       │1/0         │1/0         │
└────┴───┴────────┴──────────┴──────────┘

  表2 H-K法在不同优化条件下提取DNA结果比较
  Table 2 Comparison of D

  ······

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【注释】                                                                                                     
【参考文献】 {1}陆裕朴,胥少汀,等.实用骨科学[M].北京:人民军医出版社,1999:4-22.
  {2}JOANNA J, AGNIESZKA M, RYAZARD P. Comparison of three methods of DNA extraction from human bones with dif- ferent degrees of degradation[J]. International Journal of Legal Medicine,2012,126:173-178.
  {3}贾东涛,韩海军,张玉红,等.陈旧骨骼DNA提取方法的应用研究[J].中国法医学杂志,2007,22(4):260-261.
  {4}苑美青,凃政,李彩霞,等.利用压力循环仪提取骨骼DNA[J].刑事技术,2011(4):29-32.
  {5}侯一平.法医DNA分析的进展[J].中国法医学杂志,2011,16(4):241-244.
  {6}凃政,刘志芳,陈松,等.牙齿DNA的提取及分型[J].刑事技术,2007(5):9-11.
  {7}IMAIZUMIA K, NOGUCHI K. DNA typing of bone specimens- the potential use of the profiler test as a tool for bone identifi- cation[J]. Legal Medicine,2005(7):31-41.
  {8}骆继怀,孙红兵,等.人骨骼及牙齿DNA提取方法的比较和优化[J].中国法医学杂志,2014,29(5):467-469.
  {9}高林林,徐念来,等.利用AutoMate ExpressTM自动化法医DNA提取系统提取骨骼及牙齿DNA[J].法医学杂志,2013,29(2):127-129.
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