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【期刊名称】 《中国刑警学院学报》
关于Y-SNP位点的研究进展
【英文标题】 The Research Progress of Y-SNP【作者】 牛青山宋志豪杜馨雨
【作者单位】 中国刑事警察学院科研处{处长、教授}中国刑事警察学院科研处中国刑事警察学院科研处
【分类】 刑事侦察学【中文关键词】 遗传;基因位点;Y-SNP;检测方法
【英文关键词】 Heredity; Genetic locus; Y-SNP, Test method
【文章编码】 2095-7939(2019)06-0117-08
【文献标识码】 A DOI: 10.14060/j.issn.2095-7939.2019.06.016
【期刊年份】 2019年【期号】 6
【页码】 117
【摘要】

Y-SNP具有突变率低、强群体特异性与适合对降解DNA检材检验的特性,在个人识别、亲权鉴定、系谱分析、Y染色体数据库构建等方面具有重要意义。随着法庭科学的发展,对Y-SNP突变率的认识日益深刻,新型(现代)分析技术也在不断更新。Y-SNP在法庭科学中的作用愈发突显,并有望成为Y-STR基因库的补充,从而以其极低的突变率保障对犯罪嫌疑人家系排查的准确率,为公安实战提供新的技术方法与手段。

【英文摘要】

Y-SNP has the characteristics of low mutation rates, strong population specificity and suitable for the testing of degraded DNA materials. It is of great significance in personal identification, paternity identification, pedigree analysis and Y chromosome database construction. With the development of forensic science, understanding Y-SNP mutation rates is increasingly profound, and new (modern) analysis techniques are constantly updated. Y-SNP plays an increasingly prominent role in forensic science, and is expected to be a supplement to Y-STR gene pool. It aims to ensure the accuracy of the investigation to the family criminal suspect with a ve low mutation rate, and to provide a new technical method and means for the actual combat of public security.

【全文】法宝引证码CLI.A.1284130    
  
  

1引言

Y-STR分型技术在法庭科学的实际案件中的亲缘排查、筛选、种群的推定,甚至个人识别都有着不可替代的作用。自Y-STR数据库在全国各地公安机关建立以来发挥了重大作用,典型的如在侦破甘肃省“白银案”中的成功应用。但随着法庭科学对Y-STR基因座的继续研究发现,目前常用的Y-filer Plus PCR Amplification Kit系统的27个Y-STR基因座普遍存在突变率较高的情况,这可能导致在实际鉴定工作中出现基因座突变而产生错误的排除。而Y-SNP凭借着其极低的突变率、强群体特异性与更短的扩增子受到法庭科学的关注{1},特别是近些年随着对Y-SNP研究的不断深入,Y-SNP位点对于法医学更突显出其重要意义与价值。

2 Y-SNP的遗传学特性

Y-SNP位点是指位于Y染色体上的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs)。单核苷酸多态性是指在基因组的水平上由单个核苷酸变异而导致DNA序列的多态性,是人类可遗传变异中非常重要的一种,在人类基因组中广泛分布,被认为是继STR后的第三代遗传标记。它主要体现为二等位基因变异,由单个基因转换(C T, G A)或巅换(C A, G T, C G, A T)导致的,基因的插入或缺失同样也可导致。目前学术上将SNP位点分为4类,包括个人识别SNP(IISNP)、家系SNP(LISNP)、祖先SNP(AISNP)与表型SNP (PISNP){2}。人体的Y染色体属于近端着丝粒染色体,包含长臂Yq短臂Yp,长度约为60Mb。位于Y染色体两端的95%为非重组区,而拟常染色区仅占总长的5%。非重组区呈现单倍型独立向下遗传,表现为由父亲传递给儿子{3}。Y-SNP突变模式目前主流学术界认为是“一次性发生”的具有时间顺序的点突变。因此,Y-SNP拥有高度的种群特异性,多Y-SNP位点所构成的系谱树已经为研究群体遗传学提供了重要帮助。由于Y-SNP位点的低突变率(约为10-9),在Y-STR基因库构建的基础上具有辅助作用,可以更好地帮助实际工作中寻找与排除家系,并有望在法医学领域的种群认定与个人识别方面发挥更重要的作用。

3 Y-SNP的特异性

在实际检验工作中,往往需要对降解或陈旧检材进行相关Y-SNP位点扩增检验,但因其极易受到其他生物样本的污染,从而增加了对Y-SNP扩增结果判断的难度。因此,对Y-SNP特异性的研究对实际工作中检材样本来源的确定具有重大意义。

Y-SNP位点在研究其特异性时与Y-STR位点类似,大体可分为种属特异性与Y染色体特异性。黄曾杰等人对人类男性的29个Y-SNP位点进行特异性研究中发现,在29个位点中有23个位点针对男性有较好的特异性,可以扩增出相应的PCR产物;29个位点中有3个位点对人,还有部分动物均有部分扩增产物,但两者长度具有显著差异;有3个位点对人还有动物有相应的扩增产物,且长度类似;有5个位点对于男性女性均有扩增产物且其长度大小类似。因此,绝大多数Y-SNP位点对男性具有较好的特异性。部分位点人与动物均可扩增出相应的片段,种属特异性差。极少数位点不具有Y染色体特异性,男性女性均可扩增出相应的片段(如M7、 P256、M178、M175、P31等),这可能与X染色体与Y染色体含有相应的同源区段相关{4}。因此,在选择Y-SNP位点时要充分考虑其选取位点的种属特异性与Y染色体特异性,这在为科研与法庭科学检验中选取Y-SNP位点时提供了一定的参考。

4 Y-SNP的突变率

Y染色体上的突变率是种群迁徙、基因、医学遗传与法医学研究的重要参数。往往由于Y染色体的突变相对独立,通常是中性的,并且成为非重组部分唯一的变异源,所以对Y染色体上遗传位点的研究可以作为良好的分子钟来研究种群、家系、迁徙等问题。因此,为了矫正这个分子钟,需要对Y染色体上各遗传位点的突变率加以研究分析。对于Y-STR突变率的研究目前在学术界已经有了一定的成果,但是对于Y-SNP突变率的了解却知之甚少。目前,在学术界对Y-SNP的大规模测序工作已经展开,并产生了几个对Y-SNP突变速率的估计。

Y-SNP突变率大体可分为遗传突变率与进化突变率。遗传突变率是指由于血统所引起的不同程度的改变,而进化突变率主要是指从人口事件中所获得的任何对该位点产生影响的任何速率(如校正因子、古DNA等)。

4.1遗传突变率

在早期研究中,Xue等人在2009年对具有单一中国血统的Y染色体进行分析,通过Sanger测序法对13代所分离的两个人的Y染色体进行检测分析,分析结果产生了4个突变,并可以在其他家庭成员中得到验证,首次揭示了Y染色体单倍群SNPs的突变。由于已知祖先出生年代与后代的数量已知,故由此可以计算其每年的遗传突变率为1.0×10-9,每一代的遗传突变率为3.0×10-8{5}。

O. Balanovsky等人在2015年对9名哈萨克斯坦人进行了Y-SNP位点的遗传学分析,这9名哈萨克斯坦人的系谱树共同构成了传统系谱树的拓扑结构,从而可以将他们与相同的历史人物联系在一起,进而分析计算遗传突变率。结果在测序深度为71×下,观察到了44个位点的改变(不排除假阳性与阴性情况的发生),测得其遗传突变率为0.78×10-9{6}。O. Balanovsky在2017年对此进行了回顾性分析,分析了从2009年至2015年4位不同学者对Y-SNP位点检测所得遗传突变率的结果,其平均值为0.89×10-9,并认为该突变率可作为一种Y染色体X退化序列良好的遗传突变率{7}。

4.2进化突变率

进化突变率主要影响因素分为两种:由校正因子带来的影响与古DNA所带来的影响。在计算Y-SNP进化突变率时主要考虑上述两种因素。

4.2.1通过校正因子所计算的进化突变率

Poznik等人在2013年对总计69条Y染色体进行了测序,并以此为基础构建了一个全球范围的Y染色体树。他们通过对外显子测序来验证43个位点,进而得出其进化突变率为0.82×10-9{8}。虽然该结果与全球线粒体DNA树的TMRCA相吻合,但是其突变率是由美国校准的特殊子树中获得的,要考虑到该血统人种种族迁徙、分离等多方面因素,故该结果具有争议性。

Francalacci等人在2013年与2015年分别对1204名撒丁岛人的Y染色体进行低测序深度(2×)与高测序深度(17×)的测序,并重点将其聚焦于Y染色体退变区。他们通过结果证实了I2a1a-δ单倍群是撒丁岛人所独有的,因为其带有明显的人口爆炸信号,分析其原因可能与新石器时代殖民统治的扩张与改造相关。通过低测序深度所检测的进化突变率为0.53×10-9,其结果由于对假阳性的高度过滤,在实际测序中可能忽略了个别突变的SNPs位点,因而所测得进化突变率偏低。通过高测序深度所检测的I2a1a-δ单倍群所得的进化突变率更快,通过标准正态分布计算所得的CI为0.62×10-9至0.68×10-9{9}。

4.2.2通过古DNA所计算的进化突变率

FU等人在2014年对一位约为45000岁的西西伯利亚人进行了完整的基因组测序(测序深度为22×),发现其古老的Y染色体与东/北欧的单倍群NO相类似。其他的研究往往使用概率论的方法直接计算突变并估计突变率,但该学者率先通过贝叶斯建模的方式在构建树的同时,也将其应用于对进化突变率的估计,估计的结果为0.76×10-9(95%CI为0.67×10-9到0.86×10-9){10}。Trombetta等人在2015年对数百个现代人样本的X退变区(1.5Mb)进行了检测,并以此为数据通过贝叶斯模型建立系统遗传树。后将其与Ust’-Ishim和欧洲旧石器时期晚期的Loshbour样本相结合,通过将古DNA的年龄加入到树中后进行分析计算,最后得到0.71×10-9的进化突变率(95%CI为0.62×10-9到0.82×10-9){11}。

4.3SNP突变率的影响因素

4.3.1测序覆盖深度与SNP过滤设置所带来的影响人丑就要多读书

由于样本本身的差异,在检测时相应参数的设置对最后突变率的测量会带来不同的影响。如为了避免假阳性与假阴性所带来的影响,在测序时要特别注意要寻找一个合适的测序覆盖深度。过低的测序深度会造成相应的错误从而造成假阴性,进而低估突变率。正如Francalacci等人通过测序深度为2×增加到17×进而增加了23%的突变率{12};当测序深度过高时,由于仪器设备的限制,就会造成精准度的偏差,从而造成假阳性。当然,同样也是由于SNP分析阈值由2增加到10进而也可以减少测序的假阳性发生率。故对SNP分析阈值的设置,O. Balanovsky认为要分局部样本(单一位置单一样本)、复合样本(单一位置多样本)与系统样本三种情况分别进行处理。

4.3.2世代传递时间对突变率所带来的影响

根据对常染色体突变率进行估算时所用计算方法的特点,世代传递时间主要以两种方式来影响对突变率的估算。第一,在对突变率进行估算时,通常所测量的值TMRCA以几代人的速度表达,后转化为以年代为单位。所以,每代人的持续时间将会直接影响到对突变率的估算。第二,随着父亲年龄的增长,随之带来突变的可能性便会加大。但幸运的是,对Y-SNP突变率的估算通常是以年为单位,因而第一种方式可以很好地被避免,但第二种方式却存在,父亲的年龄增加了突变率,并随着世代而变化。因此,男性的青春期年龄、男性精子生长周期与男性生育平均年龄对突变率的估算都将产生影响。

4.3.3在Y染色体的回文序列与X退化序列突变率的差异

尽管学术界在研究Y-SNP的突变率时重点关注X退化序列,但是Helgason等人在2015年预见性地将大量基于血缘基础的数据,应用于对Y染色体扩增序列中的回文序列、X退化序列与X转位序列。其在研究中发现,在X退变序列中并没有回文序列与X转位序列所含有的旁系同源基因,而该基因是研究对Y-SNP的突变率进行估算的主要研究对象。因此,如果发生突变,则不能确定具体是哪个序列中携带了该突变,则每个序列都被认为是含有突变的,突变大小分别占33%。最后必须通过这些突变在不同序列中的权重来分别进行计算,进而得到一个无偏见的Y-SNP突变率。该学者发现,在这些区域中,回文序列的突变率最低(0.74×10-9,CI: 0.64×10-9-0.85×10-9),X退化序列的突变率最高(0.89×10-9,CI: 0.80×10-9-0.99×10-9){13}。

5 Y-SNP分析技术

自20世纪DNA的发现到现如今,经历了近百年的SNP分析技术已日益成熟,但由于SNP独特的生理结构特点导致了其各类分析方法均无法达到最完美的结果。目前学术界对SNP位点的研究主要集中在两个方面:其一为对SNP位点进行筛选,从而建立SNP数据库;其二为对不同SNP位点的功能进行研究,从而为医学领域治疗、用药或预防等提供帮助。因此,就法医学对SNP进行分析时,主要应当结合样本条件与实验要求等进行综合分析,分析方法既要在拥有良好的复合扩增体系的同时保证高精准度,也应兼顾高通量与低成本问题,进而选取最恰当的方式。

对于Y-SNP来说,目前所用分析技术与常染色体SNP相类似,主要分为两类:传统凝胶检测法与新型(现代)分析技术方法。其中传统凝胶的分析方法主要包括PCR-RFLP、单链构象多态性分析技术(SSCP)、等位基因特异性探针(ASO)等。新型(现代)分析技术方法主要包括DNA芯片技术、变性高效液相色谱分析(DHPLC)、TapMan荧光探针技术、MassARRAY质谱分析技术、SNaPShot技术、基质辅助激光解吸电离/飞行时间(MALDITOF)质谱法等。传统分析技术由于其通量低、成本高、时间长的缺点,较少应用于Y-SNP的分析中,对此,本文不再赘述。对于高通量的分析方法,目前SNaPShot技术以其独特的优势被大量应用于Y-SNP的分析。

5.1变性高效液相色谱分析(DHPLC)

DHPLC技术是在温度调控高效液相色谱技术(TmHPLC)的基础上改进而来的,通过固定相对相同长度片段内部不同碱基对亲和力的不同,从而将3’端按照C、G、A、T的顺序依次洗脱,因而该方法可以分析目的片段与已知片段之间的微小差异。由于该方法在分析进样前无需对样本进行纯化,因此在实际操作中可以应用于高通量的基因分析。但该分析方法不能测出变异位点的具体序列,需要更进一步的测序。正是该方法具有的高通量、操作简便、高效、检出率高(95%~100%)特点,故被广泛地应用于变异SNP位点的发现与筛查{14}。

石美森在2005年首次将DHPLC技术应用于对Y-SNP位点的分析研究。该学者通过将Y染色体M9、M35、M98三个SNP位点进行SNuPE复合位点扩增,后将得到的扩增样本在完全变性的条件下用DNASep?分析柱进行洗脱{15}。根据DNA分析片段的长度及每条单链碱基不同构成的顺序被依次洗脱,然后以峰值的形式记录下来,随后通过分析同一条件下所检测样品的图谱来确定基因型。该方法操作简便、快捷,同时由于无需对扩增样本进行纯化,因此适用于高通量的Y-SNP分型。但由于其本身技术特点限制,尚不能用于明确变异,只能对Y-SNP变异进行初筛、初检,最后仍然需要测序来明确具体变异。

5.2生物质谱技术(MS)

质谱是通过测定待测样品电离后离子的质荷比来判断样品的构成与性质的,最早应用于蛋白质的

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【注释】                                                                                                     
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