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【期刊名称】 《刑事技术》
微滤法分离人血中脱落上皮细胞
【英文标题】 Microfiltration to Isolate the Exfoliated Epithelial Cells in Human Blood for STR Test
【作者】 朱典高珊张颖张广峰聂昊刘开会
【作者单位】 公安部物证鉴定中心公安部物证鉴定中心公安部物证鉴定中心公安部物证鉴定中心公安部物证鉴定中心公安部物证鉴定中心
【中文关键词】 微孔滤膜;细胞分离;DNA检验;混合生物检材
【英文关键词】 microfiltration membrane; cell isolation; DNA test; mixed biological sample
【文章编码】 1008-3650(2019)01-0079-04【文献标识码】 A
【期刊年份】 2019年【期号】 1
【页码】 79
【摘要】 目的建立基于微滤技术分离检验人血中脱落上皮细胞的新方法。方法选用微孔滤膜并构建细胞分离过滤平台,优化过滤参数;制备15组混合细胞悬液,每组包含2个等比例混合的样本,1个进行常规DNA检验,另1个经过滤平台过滤,取滤膜作DNA检验,对比两者的STR分型结果,评判过滤平台的细胞分离效果。结果当流量为250mL/h、滤膜孔径30μm时,白细胞滤除率可达90%以上,而脱落上皮细胞截留率不低于70%;对15组混合细胞悬液经分离检验,14组获得预期结果。结论该方法可用于人血中脱落上皮细胞的分离检验,能够改善此类检材中目的细胞的STR分型结果,为刑事案件中血迹浸染的烟蒂等混合生物检材的细胞分离检验提供了一种新思路。
【英文摘要】 Objective To establish a new method for exfoliated epithelial cells to isolate from the contaminated human blood based on microfiltration technology. Methods A filtering platform was built from the selected microfiltration membrane for cell isolation, with optimization of the items of pore size and flowing rate.15 groups of equally-pair-mixed individual-different cell suspensions were prepared, with each group containing two identical suspensions, one of which was directly treated with the routine standard DNA extraction/test and the other firstly with the filtering platform and then undergone the DNA release and harvest so that the STR typing was carried out and compared with the corresponding standard one. Results When flowing rate is at 250mL/h and membrane-pore of 30μm, the removal of white blood cells reaches up to 90%, with more than 70% of the exfoliated epithelial cells being retained.14 out of the 15 groups of the suspensions meet the desired requirements. Conclusions The method is applicable to the isolation of exfoliated epithelial cells in human blood, helpful to optimize the STR typing of the target cells in mixed samples, thus providing a new approach in dealing with mixed biological samples, e.g., the blood-stained cigarette butts.
【全文】法宝引证码CLI.A.1253074    
  
  刑事案件中,嫌疑人遗留在现场的血迹浸染的烟蒂、手套等人血与脱落上皮细胞混合的生物检材屡见不鲜。由于受害人血的污染,常规DNA检验结果多为混合STR(短串联重复序列)分型,甚至因污染人血的优势扩增而导致仅获得受害人的单一STR分型,这不仅增加了结果分析的难度,更可能丢失指证犯罪嫌疑人的重要证据。目前,法医学中关于混合生物检材细胞分离的方法主要有:免疫磁珠定向捕获、流式细胞仪、显微捕获、激光捕获显微切割、微流体芯片技术等,上述方法虽可高精度地定向捕获目的细胞,但也存在着样本前处理繁琐、设备耗材昂贵、操作复杂等诸多问题,难以在基层公安机关DNA实验室推广应用。
  微滤技术,其基本原理属于筛网过滤,在静压差的作用下,利用膜的“筛分”作用,小于膜孔的粒子可通过滤膜,大于膜孔的粒子则被截留到膜面上,从而使大小不同的组份得以分离{1},而使其成为一项成熟、简便的分离技术{2},便利于大小不同的人体细胞的分离。Ladd等{3}将11μm的尼龙膜置于经特殊处理的2μm滤膜之上,制作成了双膜过滤器ISOPORE Track-Etch Filter,被消化过的二倍体细胞的DNA及杂质能通过此膜,而精子细胞则被滞留于膜表面,从而实现了精子细胞的分离。邵武等{4}利用相似的原理,取精阴混合斑检材经第一步消化后的混合液,加入精子富集柱中离心,使小分子物质透过,而精子细胞被特异性粘附和拦截在富集层中而被分离。这些方法均属于微滤技术在法医遗传学领域细胞分离检验中的应用,但其受限于制作工艺,分离效果或并不理想。随着材料学及制备工艺的发展,尤其是精密加工技术的不断进步,微滤技术在白细胞过滤分离{5-6}、循环肿瘤细胞分离捕获{7-8}等医学领域正发挥着重要的作用,体现出高选择性、高分离效率、装置简单、操作便捷等优特点。本文基于微滤技术建立细胞分离装置,探索解决上述难题的新方法。
  1材料与方法
  1.1主要仪器与耗材
  QubitTM 3荧光定量仪(Thermo Fisher scientific, US),9700型PCR扩增仪(Applied Biosystems corporation, US),ABI3500xL型遗传分析仪(Applied Biosystems corporation, US),ID Plus PCR扩增试剂盒(Applied Biosystems corporation, US),Magattract? M48 DNA Manual kit(Qiagen, Germany),尼龙网隔膜(Merck Millipore corporation, Ireland),Swinnex可换膜过滤器(Merck Millipore corporation, China),高精度一次性流量输液调节器(DELTA MED s.r.l, Italia),一次性输液器,一次性注射器(5 mL)。按知情同意原则选取并采集多名志愿者的血样与口腔拭子。
  1.2过滤平台的构建
  利用一次性输液器构建储液槽、流体通路和控制阀门的装置组合体;利用尼龙网格膜、可换膜过滤器(直径25 mm)构建滤芯,利用高精度一次性流量输液调节器的流量调节器(5~250 mL/h,可达容积泵精度)构建流量控制器,将上述各部件组合集成为用于细胞分离检验的过滤平台,如图1。
  (图略)
  图1过滤平台示意图
  Fig.1 Diagram of the filtering platform
  1.3过滤参数
  1.3.1滤膜孔径
  人血中的红细胞、白细胞以及血小板,其直径范围分别为5~9、7~20、2~4μm,而脱落上皮细胞直径范围为40~60μm,因此利用细胞直径大小不同可对其进行物理分离,故滤膜孔径应介于两者之间(20~40μm),而商品化尼龙网格膜的孔径在此范围内的仅有30μm一种,故选择孔径30μm的尼龙网格膜 (图2)作为过滤平台的滤膜。
  图2孔径30μm的尼龙网格膜(放大20×10倍)
  Fig.2 Nylon filtering membrane with a pore size of 30μm (magnified to 20×10fold)
  1.3.2流量
  不同流量下的白细胞滤除率:取4个1.5 mL EP管,各取2μL1号志愿者的血样,并分别加入1 mL生理盐水,涡旋振荡10 s,用1000μL移液器反复吹打,制备为血细胞悬液;取其中1管,13000 r/min离心3 min去上清液,沉淀物备检(对照组);其余3管利用上述过滤平台,以不同流量(60、120、250 mL/h)过滤,取下滤膜分别置于3个1.5 mL EP管内备检(过滤组1、2、3);向以上4个EP管内加入300μL G2裂解液(来自Magattract? M48 DNA Manual kit)和20μL蛋白酶K(10 mg/mL),56℃孵育2 h,用Magattract? M48 DNA Manual kit进行磁珠纯化,将提取到的DNA用QubitTM 3荧光定量仪定量,依据公式“[(对照组DNA定量值-过滤组DNA定量值)/对照组DNA定量值]×100%”计算不同流量下的白细胞滤除率。对2、3、4、5号志愿者血样,同样做上述实验。结果显示,流量为250 mL/h时,该过滤平台的白细胞滤除率可稳定保持在90%以上(表1),平均滤除率93.6%,效果最佳。
  表1不同流量下的白细胞滤除率
  Table 1 Removal of white blood cells under the varied flowing rates

┌─────────┬────────────────────────────────┐
│流量/(mL/h)    │血样中白细胞滤除率/%                      │
│         ├──────┬──────┬──────┬──────┬────┤
│         │1号     │2号     │3号     │4号     │5号   │
├─────────┼──────┼──────┼──────┼──────┼────┤
│60        │94.7    │66.8    │85.2    │76.3    │79.8  │
├─────────┼──────┼──────┼──────┼──────┼────┤
│120        │91.6    │66.1    │89.0    │50.4    │84.2  │
├─────────┼──────┼──────┼──────┼──────┼────┤
│250        │90.4    │94.3    │93.4    │92.1    │97.9  │
└─────────┴──────┴──────┴──────┴──────┴────┘

  不同流量下脱落上皮细胞的截留率:取1号志愿者口腔拭子1枚,剪下棉头置于1.5 mL EP管内,加入1mL生理盐水,涡旋振荡10 s, 8000 r/min套管离心5 min去载体,沉淀物及上清液涡旋振荡10 s,用1000μL移液器反复吹打,制备为脱落上皮细胞悬液;取100μL细胞悬液置于1.5 mL EP管内,13000 r/min离

  ······

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【注释】                                                                                                     
【参考文献】 {1}许亚夫,邹大江,熊俊.滤膜材料及微滤技术的应用[J].中国组织工程研究与临床康复,2011, 15(16):2949-2952.
  {2}张建军.膜分离技术的研究与应用[J].广州化工,2015, 43(7):23-24.
  {3}刘琳,陈水琴,胡志敏,等.混合斑中精子细胞分离方法的应用研究进展[J].生命科学研究,2014, 18(1):55-59.
  {4}邵武,姜先华,孙学科,等.精子富集柱分离技术的研究[J].中国法医学杂志,2009, 24(3):194-196.
  {5}林东灿,黄宛榛,罗仕錡,等.红细胞专用去除白细胞过滤平台的研发[J].中国输血杂志,2010, 23(10):771-774.
  {6}张月萍,卢小莲,罗世彬,等.去白细胞血液的制备及血液质量分析[J].右江民族医学院学报,2014, 36(6):900-901.
  {7}邓勇,林金明.循环肿瘤细胞分离捕获方法研究进展[J].分析科学学报,2014, 30(5):727-734.
  {8}曹璐,徐文,殷正丰.循环肿瘤细胞分离与检测[J].第二军医大学学报,2010, 31(3):313-316.
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