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【期刊名称】 《刑事技术》
应用mtDNA序列分析技术鉴定嗜尸性蝇类种属的研究进展
【英文标题】 Research Progress about mtDNA Sequencing to Identify the Species of Sarcosaphagous Flies
【作者】 杨静波刘龙王江峰
【作者单位】 河北省公安厅刑事侦查局巴州公安局刑侦支队苏州大学苏州医学院法医系
【中文关键词】 法医昆虫学;mtDNA; 嗜尸性蝇类
【英文关键词】 forensic entomology; mtDNA; sarcosaphagous flies
【文章编码】 1008-3650(2019)01-0060-06【文献标识码】 A
【期刊年份】 2019年【期号】 1
【页码】 60
【摘要】 随着法医昆虫学的不断发展,应用嗜尸性昆虫的生长发育规律和尸体上昆虫演替规律推断死亡时间成为可能,但这要求快速、准确地鉴别嗜尸性昆虫的种属,然而,办案人员通常无法从形态上鉴别昆虫幼虫的种属,而对成虫的形态学种属鉴定知识也往往所知甚少,因此限制了相关技术在案件侦破中的广泛应用。自1994年sperling利用mtDNA序列分析方法进行种属鉴定以来,国内外许多研究者在此基础上进行了大量的尝试与探索,特别是近十几年,国内研究者在借鉴国外研究成果的基础上,在全国不同地域采集蝇类标本进行序列分析研究,在提取方法、基因片段种属鉴定效果、种属鉴定应用等方面取得了较大的研究成果。本文试图对国内近几年的研究进行总结,从而为后续研究提供参考。
【英文摘要】 Forensic entomology can provide clues for investigators to estimate the postmortem interval based on the growing and developing patterns of sarcosaphagous pupas showing their metamorphous evolutions on the corpses. However, only a few experts are able to master how to identify the species of sarcosaphagous pupas or flies using the morphology knowledge, thereby limiting the application of such entomologic capability into criminal detection. Fortunately, a large number of attempts both home and abroad have been explored to authenticate the sarcosaphagous pupas or flies with their mtDNA (mitochondrial DNA) sequencing since Sperling made such a kind of identification in 1994, having obtained plenty of achievements. Domestic researchers also acquired great progress on the aspects of collecting samples, evaluating the species identification through sequencing the relevant gene fragments of mtDNA, applying the method of species identification at the basis of gathering various flies specimens in different regions nationwide, and analyzing the flies’ targeted mtDNA sequences.This review intends to make a summary about the latest domestic researches on this tendency.
【全文】法宝引证码CLI.A.1253073    
  
  死亡时间(postmortem interval, PMI)推断一直是法医学研究的重点和难点,这是由于随着尸体的不断腐败,各种尸体现象及胃内容消化程度等可用信息会先后失去价值,及至晚期便使死亡时间的推断成为一大难题。研究表明,利用嗜尸性蝇类生长发育规律及尸体上昆虫演替规律即便在晚期也可准确地推断死亡时间{1-2},然而,案件现场所发现收集到的往往是蝇类的幼虫,形态上无法鉴别种属,即使现场能够收集到成虫,由于蝇类形态学种属鉴定的专业性很强,多数办案人员也不能鉴别种属,这些因素均限制了这一规律的实际应用。蝇类是形态变化的昆虫,各个阶段(幼虫、蛹、成虫)mtDNA具有同一性,故结合现已成熟的DNA序列分析技术,利用不同蝇种mtDNA遗传信息的差异性快速、高效、低耗地鉴别嗜尸性蝇类便成为可能。理论上讲,利用已知成虫的mtDNA,建立序列数据库,再将所得被检幼虫或成虫的mtDNA在数据库中进行搜索比对,就可鉴别出幼虫或成虫的种属,从而根据嗜尸性昆虫生长发育规律和尸体上昆虫演替规律推断出死亡时间。mtDNA序列具有易于分析、含有丰富的进化信息和易获取等优点。蝇类mtDNA与核DNA相比还具有相对较高的碱基可变区,遵循严格的母系遗传,进化分歧率较高,加之又较少基因重组现象,更易提取和分离{3},且其对样本保存条件的要求也不苛刻。因此,mtDNA作为重要的分子标记之一,适用于对各种发育阶段的嗜尸性蝇类进行种属鉴定{4}。世界上已有许多利用mtDNA进行嗜尸性蝇类种属鉴定的研究报导,如亚洲的中国、日本;欧洲的英国、法国、德国、捷克;美洲的加拿大、美国;澳洲的澳大利亚,等等。我国嗜尸性蝇类种属鉴定的研究虽起步较晚,但近十几年,随着蔡继峰、王江峰等很多研究者利用mtDNA基因序列分析技术在我国近20个省、直辖市,对约30种常见嗜尸性蝇类进行种属鉴定的研究,也大大拓展了标本采集的地域和种类,扩大了基因库的数据量,研究成果亦颇丰硕。
  1提取方法的研究
  1.1不同提取方法的对比
  陈瑶清等{5}应用十二烷基硫酸钠-醋酸钾(SDSKAc)法、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法和十二烷基硫酸钠-蛋白酶K(SDS-PK)法分别对常见嗜尸性昆虫的新鲜和陈旧样本提取mtDNA,并比较了以上提取方法的提取效果,得出以下结论:三种方法均可有效提取mtDNA ;CTAB法对陈旧样本提取效果最佳;SDS-KAc法可在预实验中使用,但对陈旧样本提取效果一般;SDS-PK法可提取到高质量的mtDNA,但是步骤繁琐、耗时较长。该研究为对DNA质量,样本新旧程度,样本量等有不同需求的研究者提供了方法依据。
  1.2不同检材提取效果的对比
  郭亚东等{6}对嗜尸性蝇类的头、胸、肢体、翅膀等不同部位的mtDNA分别采用改良的CTAB法进行提取,发现胸部肌肉均提取成功,头部大部分能提取成功;翅膀的提取成功率较低;甲虫的四肢肌肉发达,提取成功率较高。故胸肌是嗜尸性蝇类mtDNA的最好检材,在没有胸肌情况下,蝇类头部、四肢也可作为检材,若无以上检材,蝇类翅膀就勉强可作为检材提取mtDNA。李学博等{7}用CTAB法研究不同保存时间的嗜尸性蝇类蛹壳和胸肌的mtDNA提取效果,同样发现胸部肌肉是优良检材,蛹壳也可成功提取到mtDNA,但是保存时间5年以上检材的mtDNA提取量明显减少。该研究提示,在实际工作中应尽早送检,或者选择合适保存方法以防止DNA降解,以免因检材失效影响案件侦破。
  2不同mtDNA基因片段的研究
  2.1细胞色素氧化酶亚基I(CO I)片段
  COI基因是mtDNA基因组中拷贝数高、序列保守度高、容易分离的一个基因。研究表明,该基因序列可应用于种属鉴别、进化研究等,且在分析进化及系统发育方面的价值较高{8}。蔡继峰等{9-10}利用COI基因278bp片段(引物为Sperling等{3}用过的C1-J2495和C1-N-2800)成功地对呼和浩特、敦煌、成都地区的3科4属6种嗜尸性蝇类进行了种属鉴别,但对近缘种铜绿蝇和丝光绿蝇的鉴别效果不佳。王江峰等{11}利用COI基因348bp片段也将西安、广州、中山三地的5种嗜尸性蝇类鉴别到种的水平,王新杰等{12}利用相同引物,发现潍坊地区6种常见嗜尸性蝇类COI基因种间差异明显。杨静波等{13}利用COI基因523bp基因片段也将广州、湛江、韶关、四川蜂蛹寨、河南沈丘5地的2科5属7种嗜尸性蝇类鉴别至种,但是在某些近缘种,如广额金蝇和肥躯金蝇之间则不能有效鉴别,这与蔡继峰等的研究结果类似。汤振楚等{14}利用COI基因278bp片段对我国12个省16个地区的嗜尸性麻蝇进行了种属鉴别,再次证实了这一基因在种属鉴定方面的价值;杨立等{15}采用相同引物扩增出的COI基因278bp片段对我国14个省不同地区的3科10属12种嗜尸性蝇类进行了种属鉴定研究,发现这一片段可较精确地鉴定大多数嗜尸性苍蝇种属(尤其是对不同属的苍蝇更为有效),但对个别不同种的苍蝇则很难鉴别。陈庆等{16}对北京地区嗜尸性蝇类优势种涉及的3科6属7种嗜尸性蝇类进行了种属鉴定研究,自行设计引物扩增COI基因106~l326 bp序列,得到了我国目前扩增嗜尸性蝇类CO I基因最长的基因片段,序列分歧统计发现种内差异均未超过l%。种间差异在7.74%~14.85%之间,截至目前,这一分歧统计是相关方面研究获得的种内与种间之间的最大差异,可有效将嗜尸性蝇类鉴别到种的水平。陈庆等亦试图通过确定COI基因不同物种、不同区段特有突变位点的组合,以不同组合位点的分型对嗜尸性蝇类进行种属鉴定,这为分析mtDNA序列进行嗜尸性蝇类种属鉴定开拓了一种新的思路,后续研究者可作进一步验证。
  2.2细胞色素氧化酶亚基II(CO II)片段
  Caterino等{17}认为CO II基因序列分析是进行系统发育研究最有效、最可靠的方法之一,国内研究者也证实了这一点,蔡继峰等{18}对呼和浩特地区采集的3科5种嗜尸性蝇类CO II基因的635 bp片段进行研究,发现此基因片段在上述5种嗜尸性蝇类的种内差异均数小于1%,种间差异大于3%,可鉴别不同蝇种个体是否同种;同时发现由于铜绿蝇、丝光绿蝇亲缘关系非常接近,该基因序列很难鉴别这两个蝇种。赵祖亮等{19}采集郑州地区5种嗜尸性蝇类,使用与上述蔡继峰等相同引物,扩增CO II基因635 bp片段,发现此基因序列分析可有效鉴别棕尾别麻蝇、巨尾阿丽蝇、亮绿蝇,但不能有效鉴别其近缘种铜绿蝇、丝光绿蝇。此外,蔡继峰等{20}分析丝光绿蝇CO II基因635 bp序列,发现丹麦瑟兰岛、英国布里斯托尔、中国呼和浩特、西班牙安达卢西亚、中国成都、津巴布韦哈拉雷、澳大利亚珀斯、新西兰南等8个地理种群的遗传距离与其地理纬度之间存在一定相关性。目前,国内外嗜尸性蝇类mtDNA中CO II基因片段研究相对较少,这可能是由于CO II基因的片段较长,扩增时易被干扰,从而不能得到理想的扩增产物,进而会影响到基因序列检测的效率和准确性,故限制了其在嗜尸性蝇类快速种属鉴定方面的应用。笔者曾经用嗜尸性蝇类胸部肌肉提取mtDNA扩增CO II基因片段,结果并不理想。
  2.3烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基5(ND5)片段
  ND5基因是mtDNA中最大的编码基因,在NADH氧化还原酶基因中,ND5基因进化速度快。国内外关于嗜尸性蝇类mtDNA中ND5基因序列的研究较少,捷克的Zehner等{21}对当地嗜尸性蝇类mtDNA中CO I和ND5基因进行了序列分析,发现种内差异不超过1%,而种间差异较大,故可用来准确地鉴定出不同种。比较ND5基因和CO I基因序列的种间差异度,发现ND5要大于CO I,故其在种属鉴定方面的效力更强。
  杨静波等{13}采集了广东、四川、河南等地的嗜尸性蝇类进行研究,发现ND5基因种内分歧率小于1.83%,种间分歧率大于2.62%;种间与种内进化分歧率范围间没有交叉,故可有效地将收集的嗜尸性蝇类鉴别到种的水平;CO I基因可将大部分嗜尸性蝇类鉴别到种的水平,但是不能有效鉴别广额金蝇和肥躯金蝇,种属鉴定效力低于ND5基因。当然,出现这样结果的原因是多方面的,可能与扩增出基因片段地突变率有关,也可能与收集样本的个体差异有关,故并不能因此否定CO I基因在嗜尸性蝇类种属鉴定方面的价值,这还有待后续研究者扩大样本,设计合适引物进行进一步验证。
  2.416S rDNA片段
  16S rDNA位于rRNA编码区,高度保守,多用于目水平上的系统发育研究{22}。国内近几年对此基因序列研究相对较多,其在嗜尸性蝇类种属鉴定方面的价值也得到了验证。孙晓明等{23}分析呼和浩特地区铜绿蝇、丝光绿蝇的16S rDNA的551 bp基因序列,发现它们的16S rDNA基因序列差异较大,可有效鉴别这两个近缘种。石坚等{24}对14个省市户外采集的丽蝇科3属6种16S rDNA的289 bp基因序列进行分析,发现上述蝇类种内进化分歧均数均为0,种间进化分歧均数为0.3%~6.5%,因而可有效快速、低耗地将上述嗜尸性蝇类鉴别到种。陈凤磊等{25}对7种嗜尸性蝇类16S rDNA的551 bp基因序列进行分析,证实此基因序列可有效进行蝇种鉴定。Li等{26}对我国17个地区的五种嗜尸性蝇类的16S rDNA的289 bp基因序列进行分析,也同样证实可利用该基因序列有效地进行嗜尸性蝇类种属鉴定。
  3四种基因序列种属鉴定效果的对比
  CO I基因是我国嗜尸性蝇类种属鉴定研究最多的基因片段,扩增片段从278~1120 bp不等,研究的蝇种及获得的基因序列数据也最多,由于该基因片段,特别是其278

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【注释】                                                                                                     
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